Luận văn Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN. 2

LỜI CÁM ƠN. 3

MỤC LỤC . 4

DANH MỤC VIẾT TẮT. 8

MỞ ĐẦU. 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2

1.1. NS trong hệ sinh thái RNM. 2

1.1.1. Giới thiệu về RNM . 2

1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM . 3

1.1.2.1. Đặc điểm hình thái. 3

1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản. 4

1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa. 4

1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi. 7

1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM .9

1.2. Chitin và chitinase. 10

1.2.1. Nguồn chitin: . 10

1.2.2. Chitinase. 13

1.2.2.1. Nguồn chitinase:. 13

1.2.2.2. Cơ chế hoạt động:. 13

1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase:. 14

1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase. 14

1.2.2.5. Phân loại chitinase . 15

1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase. 16

1.2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase. 191.2.3.1. Một số chủng NS có HT chitinase cao. 19

1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS. 20

1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngoài nước . 21

1.3.1. Ngoài nước. 21

1.3.2. Trong nước. 24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 25

2.1. Vật liệu. 25

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. 25

2.1.2. Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ . 25

2.1.3. Môi trường . 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu. 27

2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống. 27

2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi. 27

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS. 28

2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5]. 28

2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL.29

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase. 29

2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy. 29

2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường

kính vòng phân giải . 30

2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu.30

2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8] . 33

2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng

NS. [4], [10], [23], [32], [33] . 35

2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuôi cấy. 35

2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy. 352.2.11.3. Khảo sát pH của MT . 35

2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy. 36

2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl. 36

2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin. 36

2.2.12. Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P. citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17].36

2.2.13. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum [4], [43], [44].39

2.2.13.1. Thu nhận tủa protein . 39

2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CPE chitinase thô [9] . 39

2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase. 39

2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của

chế phẩm enzyme chitinase [4], [20]. 40

2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm

[4], [46]. 41

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 42

3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ

. 42

3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được . 43

3.2.1. Chủng nấm số 16 . 43

3.2.2. Chủng nấm số 10 . 45

3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2

chủng NS P. citrinum và A. protuberus. 47

3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy. 47

3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy . 48

3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy. 51

3.3.6. Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuôi cấy. 533.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả

năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum. 55

3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum . 58

3.4.1. Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NHR4 R)R2 RSOR4 R15T. 58

3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase. 58

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thô. 60

3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại cây trồng .62

3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani.62

3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 66

4.1. Kết luận. 66

4.2. Kiến nghị. 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 67

PHỤ LỤC. 74

PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE. 74

PHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD . 75

PHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM. 76

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH. 77

PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU.