Luận văn Nghiên cứu tạo chế phẩm Enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma SP. phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN . 1

LỜI CAM ĐOAN . 2

MỤC LỤC . 3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. 6

MỞ ĐẦU. 7

1. Lí do chọn đề tài.7

2. Mục tiêu .8

3. Nhiệm vụ.8

4. Đối tượng nghiên cứu .8

5. Ý nghĩa của đề tài .8

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 10

1.1. Nấm Trichoderma spp. .10

1.1.1. Vị trí phân loại .10

1.1.2. Đặc điểm sinh học.10

1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp.11

1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng.12

1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp.14

1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase .16

1.2.1. Chitin.16

1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase .17

1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase .18

1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm.19

1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase.20

1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp. .21

1.2.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase .23

1.3. Vi nấm gây hại trên cà chua .27

1.3.1. Đặc điểm sinh thái cây cà chua.27

1.3.2. Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con).28

1.3.3. Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua.29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 32

2.1. Vật liệu.32

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .324

2.1.2. Hóa chất - Nguyên liệu .32

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .32

2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng.33

2.2. Phương pháp nghiên cứu .34

2.2.1. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán

trên MT thạch.34

2.2.2. Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khoáng .35

2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái NS.35

2.2.4. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS.36

2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase.37

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn.38

2.2.7. Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy.39

2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase

của CPE.39

2.2.9. Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane.40

2.2.10. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ

chitinase của NS.40

2.2.11. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE

chitinase .41

2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi

CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác .42

2.2.13. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh

cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác .43

2.2.14. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] .44

2.2.15. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19].45

2.2.16. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14] .45

2.2.17. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phòng vi nấm gây hại trên

cây cà chua.46

2.2.18. Phương pháp xử lí số liệu thống kê .47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. 48

3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao .48

3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng

Trichoderma BL2 .49

3.2.1. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn.49

3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng .515

3.2.3. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng.53

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy.54

3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy.55

3.2.6. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy .56

3.2.7. Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2.58

3.3. Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng TrichodermaBL2 .59

3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính của CPE .59

3.3.2 Quy trình thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 .60

3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE .62

3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng.62

3.4.2. Ảnh hưởng của pH phản ứng.63

3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng .64

3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase của CPE .65

3.5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của CPE chitinase thô từ chủng

Trichoderma BL2 phòng trừ vi nấm gây bệnh cây trồng.67

3.5.1. Khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh.67

3.5.2. Khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh.69

3.6. Kết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân

kháng nấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua .74

3.6.1. Ở các lô gây nhiễm Phytophthora sp.74

3.6.2. Ở các lô gây nhiễm Fusarium sp .76

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 82

PHỤ LỤC . 88