Luận văn Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn dna vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α

MỤC LỤCTrangLời cảm ơn . iTóm tắt . iiMục lục .iiiDanh sách các chữ viết tắt . viiDanh sách các hình . viiDanh sách các bảng . ixPHẦN 1. MỞ ĐẦU . 11.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục tiêu của đề tài. 21.3 Nội dung thực hiện . 2PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 32.1 Hiện tương biến nạp ở vi khuẩn . 32.1.1 Giới thiệu về hiện tượng biến nạp . 32.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tượng biến nạp . 32.1.3 Cơ chế của hiện tượng biến nạp . 52.1.4 Vai trò của hiện tượng biến nạp . 52.1.5 Ứng dụng của hiện tượng biến nạp . 5 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp . 62.2.1 Khái niệm chung các vector . 62.2.2 Plasmid . 72.2.2.1 Cấu trúc . 72.2.2.2 Tính chất của plasmid . 82.2.2.3 Phân loại plasmid . 82.2.3 Phage . 92.2.4 Chủng chủ E.coli . 92.3 Các ezyme dùng trong biến nạp . 102.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) . 11 2.3.1.1 Hiện tượng giới hạn . 112.3.1.2 Tên gọi các RE . 112.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn . 122.3.1.4 Các RE loại II . 122.3.2 Các enzym thông dụng khác . 152.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) . 152.3.2.2 Taq polymerase . 152.3.2.3 Terminal transferase . 152.3.2.4 Các DNase . 152.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa . 162.3.3 Các enzym nối DNA . 162.3.3.1 E.coli DNA ligase . 162.3.3.2 T4 DNA ligase . 162.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp . 172.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 172.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp . 172.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp . 182.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp . 182.4.3 Chiết tách DNA plasmid . 192. 5 Điện di (Electrophoresis) . 192.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước . 202.6.1 Ngoài nước . 202.6.2 Trong nước . 21PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 223.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp . 223.2 Vật liệu nghiên cứu . 223.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α. 223.2.2 pBluescript II SK(+/-) . 223.2.3 Đoạn DNA . 233.3 Dụng cụ và hóa chất . 233.3.1 Dụng cụ thí nghiệm . 23 3.3.2 Các thiết bị máy móc . 233.3.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn . 233.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm . 243.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm . 243.4 Phương pháp nghiên cứu . 253.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 253.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩnE.coli DH5α và kiểm tra . 263.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trường LB . 273.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 273.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩnE.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) . 273.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra . 293.4.6.1 Chiết tách plasmid . 293.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) . . 323.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose . 323.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR . 333.4.7.1 Phương pháp tinh sạch DNA . 333.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel . 333.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX . 343.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR . 353.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) . 363.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) . 37PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 384.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 384.2 Tách chiết DNA plasmid . 404.2.1 Tách chiết DNA plasmid . 40 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTMPlasmid Mini Kit . 424.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV . 424.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII . 444.4.1 Tinh sạch đoạn DNA. 444.4.2 Tinh sạch plasmid . 454.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp . 464.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 46PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 485.1 Kết luận . 485.2 Kiến nghị . 49

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn . i

Tóm tắt . ii

Mục lục .iii

Danh sách các chữ viết tắt . vii

Danh sách các hình . vii

Danh sách các bảng . ix

PHẦN 1. MỞ ĐẦU . 1

1.1 Đặt vấn đề . 1

1.2 Mục tiêu của đề tài. 2

1.3 Nội dung thực hiện . 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

2.1 Hiện tương biến nạp ở vi khuẩn . 3

2.1.1 Giới thiệu về hiện tượng biến nạp . 3

2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tượng biến nạp . 3

2.1.3 Cơ chế của hiện tượng biến nạp . 5

2.1.4 Vai trò của hiện tượng biến nạp . 5

2.1.5 Ứng dụng của hiện tượng biến nạp . 5

2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp . 6

2.2.1 Khái niệm chung các vector . 6

2.2.2 Plasmid . 7

2.2.2.1 Cấu trúc . 7

2.2.2.2 Tính chất của plasmid . 8

2.2.2.3 Phân loại plasmid . 8

2.2.3 Phage . 9

2.2.4 Chủng chủ E.coli . 9

2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp . 10

2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) . 11

2.3.1.1 Hiện tượng giới hạn . 11

2.3.1.2 Tên gọi các RE . 11

2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn . 12

2.3.1.4 Các RE loại II . 12

2.3.2 Các enzym thông dụng khác . 15

2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) . 15

2.3.2.2 Taq polymerase . 15

2.3.2.3 Terminal transferase . 15

2.3.2.4 Các DNase . 15

2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa . 16

2.3.3 Các enzym nối DNA . 16

2.3.3.1 E.coli DNA ligase . 16

2.3.3.2 T4 DNA ligase . 16

2.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp . 17

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 17

2.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp . 17

2.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp . 18

2.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp . 18

2.4.3 Chiết tách DNA plasmid . 19

2. 5 Điện di (Electrophoresis) . 19

2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước . 20

2.6.1 Ngoài nước . 20

2.6.2 Trong nước . 21

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp . 22

3.2 Vật liệu nghiên cứu . 22

3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α. 22

3.2.2 pBluescript II SK(+/-) . 22

3.2.3 Đoạn DNA . 23

3.3 Dụng cụ và hóa chất . 23

3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm . 23

3.3.2 Các thiết bị máy móc . 23

3.3.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn . 23

3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm . 24

3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm . 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu . 25

3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 25

3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn

E.coli DH5α và kiểm tra . 26

3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trường LB . 27

3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 27

3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn

E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt

(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) . 27

3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra . 29

3.4.6.1 Chiết tách plasmid . 29

3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid

(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) . . 32

3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose . 32

3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR . 33

3.4.7.1 Phương pháp tinh sạch DNA . 33

3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel . 33

3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX . 34

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR . 35

3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn

DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) . 36

3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) . 37

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 38

4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn . 38

4.2 Tách chiết DNA plasmid . 40

4.2.1 Tách chiết DNA plasmid . 40

4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTMPlasmid Mini Kit . 42

4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV . 42

4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII . 44

4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA. 44

4.4.2 Tinh sạch plasmid . 45

4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp . 46

4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 46

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 48

5.1 Kết luận . 48

5.2 Kiến nghị . 49

TÀI LIỆU LUẬN VĂN CÙNG DANH MỤC

TIN KHUYẾN MÃI

  • Thư viện tài liệu Phong Phú

    Hỗ trợ download nhiều Website

  • Nạp thẻ & Download nhanh

    Hỗ trợ nạp thẻ qua Momo & Zalo Pay

  • Nhận nhiều khuyến mãi

    Khi đăng ký & nạp thẻ ngay Hôm Nay

NẠP THẺ NGAY