Luận án Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN . i

LỜI CẢM ƠN. ii

TÓM TẮT .iii

ABSTRACT .iv

MỤC LỤC. v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.vi

DANH MỤC BẢNG.vii

DANH MỤC HÌNH.viii

MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1. 4

TỔNG QUAN . 4

1.1. Cây Bạch hoa xà. 4

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại. 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái . 4

1.1.3. Thành phần hóa học . 5

1.1.4. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX . 6

1.2. Plumbagin . 7

1.2.1. Cấu trúc và đặc tính hóa học . 7v

1.2.2. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật . 7

1.2.3. Hoạt tính của Plumbagin . 8

1.2.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa. 8

1.2.3.2. Hoạt tính kháng viêm. 9

1.2.3.3. Hoạt tính kháng ung thư.10

1.2.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn .12

1.2.3.5. Hoạt tính kháng nấm .13

1.2.4. Độc tính của plumbagin .13

1.2.5. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật.16

1.3. Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật .20

1.3.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật .20

1.3.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp.21

1.3.3. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật.24

1.4. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp .25

1.4.1. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật .27

1.4.2. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes .28

1.4.2.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .28

1.4.2.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế

bào thực vật.29

1.4.2.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

trong mô thực vật.32

1.4.2.4. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes.39

1.5. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật .40

1.5.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ .41v

1.5.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy .41

1.5.3. Ảnh hưởng của elicitor.43

1.5.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp .44

CHƯƠNG 2.48

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.48

2.1. Vật liệu .48

2.1.1. Nguyên vật liệu .48

2.1.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy.49

2.2. Phương pháp thực nghiệm .49

2.2.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho

chuyển gen.49

2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu . 49

2.2.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ. 50

2.2.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro . 52

2.2.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch

hoa xà in vitro. 52

2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ .54

2.2.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ.54

2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn

hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR. 56

2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt

chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà .58

2.2.3.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường.58v

2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng

của rễ tơ .59

2.2.3.3. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ .59

2.2.3.4. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu .60

2.2.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng.60

2.2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ .61

2.2.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ .62

2.2.4.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC .62

2.2.4.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) .63

2.2.4.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC .63

2.2.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của

Plumbagin .64

2.2.6. Xử lý số liệu.67

CHƯƠNG 3.68

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .68

3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro.68

3.1.1. Xác định điều kiện khử trùng mẫu .68

3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ.70

3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro.73

3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa

xà in vitro.75

3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà .79

3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ .79v

3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ.85

3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin .87

3.3.1. Trạng thái môi trường .87

.

3.3.2. Điều kiện chiếu sáng.88

3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ

tơ.89

3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi

cấy .91

3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng.92

3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh

trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy.94

3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin

.101

CHƯƠNG 4.107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.107

4.1. Kết luận .107

4.2. Đề nghị.108

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .109

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .110

TÀI LIỆU THAM KHẢO .

PHỤ LỤC