Luận án Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh họ

MỤC LỤC

TRANG

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 5

1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dược liệu 5

1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu 5

1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc

sức khỏe cộng đồng 10

1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính

sinh học trong nấm dược liệu 15

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính

sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta 16

1.2. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. 17

1.2.1. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. 17

1.2.2. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học 18

1.2.3. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấmĐầu khỉ 18

1.2.4. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H. erinaceus 19

1.2.4.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ 19

1.2.4.2. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu chonấm Đầu khỉ 20

1.2.5. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước 25

1.2.6. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả

thể và hệ sợi nấm dược liệu 30

1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn 30

1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng 30

1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự

hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 31

1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự

hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 32

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1. Vật liệu 34

2.2. Các loại môi trường 36

2.3. Phương pháp nghiên cứu 39

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập

giống nấm Đầu khỉ 39

2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39

2.3.1.2. Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40

2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân

lập giống gốc 41

2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu

khỉ dạng dịch thể các cấp. 42

2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung

tích 200 ml) 42

2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung

tích 2000 - 5000 ml) 43

2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi

trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít) 44

2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịchthể 45

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ

trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể. 46

2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46

2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ

trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể. 47

2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 47

2.3.4. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit

amin trong nấm Đầu khỉ 49

2.3.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận

polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ 49

2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể

nấm nấm Đầu khỉ 49

2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 50

2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 50nấm 50

2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 50

2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các

dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro 51

2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3

chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 52

2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm 53

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 54

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus 50

3.1.1. Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ

H. erinaceus trên diện hẹp 51

3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ

nghiên cứu tuyển chọn 51

3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảonghiệm 52

3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại

của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu 57

3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấmĐầu khỉ He1 59

3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 61

3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ

sợi nấm Đầu khỉ 61

3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập 63

3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập

giống nấm Đầu khỉ 65

a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợigiống gốc 65

b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi 66

c. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự

sinh trưởng của sợi nấm 68

3.1.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70

3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm

Đầu khỉ dạng dịch thể 73

3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích200ml) 73

3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 73

3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng

dịch thể trung gian cấp 1 74

3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến 76

sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể

3.2.1.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển

sang môi trường dịch thể 76

3.2.1.5. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian

cấp 1 dạng dịch thể 77

3.2.1.6. Chế độ nuôi giống 77

a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc 80

b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 81

3.2.1.7. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm

Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 82

3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích

2000ml – 5000ml) 85

3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinhdưỡng 85

3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống

trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 86

3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch

thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 87

3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển

sang môi trường dịch thể 88

3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung

tích 2-5 lít 89

3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dungtích 2-5 lít 90

3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống

trung gian cấp 2 dạng dịch thể 92

3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 95

3.2.3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể

tích 120 lit 95

3.2.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng

môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 95

3.2.3.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch

thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít 96

3.2.3.4. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên

men thể tích 120 lít 97

3.2.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng

dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men) 98

3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm

Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể. 104

3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm

bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ

sợi nấm Đầu khỉ104

3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương

pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá

trình nuôi trồng thu quả thể107

3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh

trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ 111

3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu

khỉ trong nuôi trồng 113

3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể 114

3.3.6. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi

trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 116

3.4. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ

nấm Đầu khỉ H. erinaceus 120

3.4.1. Nghiên cứu quy trình tách chiết 120

3.4.1.1. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 120

3.4.1.2. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH 120

3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ

He1 trong từng thời điểm nuôi 122

3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm

Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng 124

3.4.4. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được 125

3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobialassay) 125

3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 126

3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên

thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid 127

3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế

phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm 128

a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1 128

a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ 129

a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế

phẩm HT1 6 tuần 129

a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên

thỏ khi dùng HT1 6 tuần 131

a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT,

SGPT của thỏ 133

a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ 134

b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩmHT1134

c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu 135

Chương 4. KẾT LUẬN 138

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI

LUẬN ÁN 141

TÀI LIỆU THAM KHẢO 142

Phụ lục 149