Khóa luận Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

MỤC LỤCLỜI CẢM ƠN . 1DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 2MỞ ĐẦU . 3CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 41.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ . 41.1.1.Phân loại. 41.1.2. Giá trị của cây thuốc lá . 51.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam . 61.2. MỘT SỐ BỆNH THưỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ . 81.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá . 81.2.2. Bệnh khảm lá do virus . 101.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC . 141.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: . 141.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh . 151.3.3. Các biện pháp canh tác. 151.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học . 151.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus . 181.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi . 181.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. . 19CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 212.1. VẬT LIỆU. 212.1.1.Vật liệu thực vật . 212.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: . 212.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng. 222.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 222.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: . 222.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo . 222.2.1.2. Gieo hạt. 222.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khu ẩn Agrobacterium tumafaciens . 232.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium. 23 2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen . 232.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy . 232.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen. 242.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh. 242.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào . 242.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương pháp PCR . 252.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số . 252.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR. 252.2.5. Phân tích khả năng kháng virus c ủa các cây chuyển gen bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo . 26CHưƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 283.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS . 283.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen . 293.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây . 293.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi . 293.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh . 323.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào. 353.2. CÁC KẾT QUẢ BưỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi. 353.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi . 353.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus . 373.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo . 373.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây . 383.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số . 383.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR . 39KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 41TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN . 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 2

MỞ ĐẦU . 3

CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4

1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ . 4

1.1.1.Phân loại. 4

1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá . 5

1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam . 6

1.2. MỘT SỐ BỆNH THưỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ . 8

1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá . 8

1.2.2. Bệnh khảm lá do virus . 10

1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC . 14

1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: . 14

1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh . 15

1.3.3. Các biện pháp canh tác. 15

1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học . 15

1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus . 18

1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi . 18

1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. . 19

CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 21

2.1. VẬT LIỆU. 21

2.1.1.Vật liệu thực vật . 21

2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: . 21

2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng. 22

2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22

2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: . 22

2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo . 22

2.2.1.2. Gieo hạt. 22

2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khu ẩn Agrobacterium tumafaciens . 23

2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium. 23

2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen . 23

2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy . 23

2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen. 24

2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh. 24

2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào . 24

2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương pháp PCR . 25

2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số . 25

2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR. 25

2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus c ủa các cây chuyển gen bằng phương

pháp lây nhiễm nhân tạo . 26

CHưƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28

3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC

LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS . 28

3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen . 29

3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây . 29

3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi . 29

3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh . 32

3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào. 35

3.2. CÁC KẾT QUẢ BưỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi. 35

3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi . 35

3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus . 37

3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo . 37

3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây . 38

3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số . 38

3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR . 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42