Đề tài Ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh lý cây trồng

2. Tổng quan lài liệu2.1. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)2.1.1 Nguyên lýVề nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài. 2.1.2 Phương phápRFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế. RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần phải có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư viện (7,8). Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai (màng celuloze hoặc màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP.2.1.3 Ứng dụng của RFLP RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể. RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây (Gebarat và cs, 1989) .v.v.

2. Tổng quan lài liệu

2.1. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

2.1.1 Nguyên lý

Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài.

2.1.2 Phương pháp

RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế. RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần phải có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư viện (7,8).

Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai (màng celuloze hoặc màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP.

2.1.3 Ứng dụng của RFLP

RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể. RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.

Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây (Gebarat và cs, 1989) .v.v.